- Главная >
- Medical and Pharmaceutical Bulletin N6'96
Medical and Pharmaceutical Bulletin N6'96
ТРАДИЦИОННАЯ МЕДИЦИНА
Канд. фарм. наук Т.Л.Киселева,
научный сотрудник Л.Н.Фролова,
кандидаты хим. наук Л.А.Баратова, С.И.Галина
Влияние мумие на внутриклеточный pH и адгезию клеток
НИИ традиционных методов лечения Минздравмедпрома РФ, Москва
Препараты мумие издавна используются в народной медицине как противовоспалительные и улучшающие регенеративные и репаративные процессы средства [1-4]. Однако, судя по данным литературы, механизм подобного действия мумие не изучен.
При заживлении ран большое значение имеет кровоснабжение пораженных участков, регулируемое свертывающей и противосвертывающей системами крови. В процессе образования сгустка крови под действием коллагена повышается адгезивность тромбоцитов, которые или образуют агрегаты, или прикрепляются к покрытому коллагеном субстрату, что сопровождается изменением внутриклеточного рН тромбоцитов [5].
Одним из факторов, участвующих в процессе заживления ран, является размножение клеток соединительной ткани (фибробластов). Современные исследования показывают, что вещества, способные вызывать размножение клеток (различные факторы роста и митогены), существенно повышают внутриклеточный рН. Искусственное поддержание низких значений внутриклеточного рН приводит к ингибированию пролиферации клеток.
В связи с этим для выяснения механизма действия мумие на живые организмы нам представлялось интересным изучить его влияние на внутриклеточный рН фибробластов и тромбоцитов, на адгезивную способность тромбоцитов с целью дальнейшего использования этих биологических тестов для оценки качества мумие.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Характеристика объекта исследования. В качестве объекта исследования использовали экстракт мумие сухой (ЭМС), полученный по оригинальной технологии из мумие-сырца алтайского, монгольского, якутского происхождения путем многократной экстракции водой и упаривания водного извлечения до остаточной влажности не более 7%.
Объекты исследования были представлены НПФ "Сибдальмумие" (Новокузнецк).
Для проведения эксперимента ЭМС растворяли в водном растворе Хенкса. При этом образовывался не истинный раствор, а многокомпонентная система, состоящая из растворившихся в воде частиц, коллоидных и нерастворимых суспендированных частиц.
Исследования проводились на тромбоцитах и фибробластах (на базе НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского).
Тромбоциты. Тромбоциты выделяли из свежей донорской крови. В качестве антикоагулянта использовали 3,5% раствор цитрата натрия (в соотношении 1:10).
Обогащенную тромбоцитами плазму получали центрифугированием крови при 700 g в течение 15 мин. Осаждение тромбоцитов проводили центрифугированием при 2300 g в течение 10 мин в присутствии 5 мкмоль ЭДТА. Тромбоциты ресуспендировали в PBS с добавлением 5 мкмоль ЭДТА и повторно центрифугировали при 2300 g в течение 10 мин. Для проведения экспериментов клетки ресуспендировали в растворе Хенкса, содержащем 10 ммоль НЕРЕS.
Фибробласты. Эмбриональные мышиные фибробласты выращивали в среде Игла, содержащей 45% гидролизата лактальбумина и 10% сыворотки крови быка.
Техника эксперимента. Для изучения влияния ЭМС на адгезивные свойства тромбоцитов и внутриклеточный рН покровные стекла с клетками помещали в чашки Петри, добавляли суспензию тромбоцитов в растворе Хенкса и инкубировали в течение 30 мин в термостате при 37о С.
При изучении адгезивных свойств тромбоцитов раствор ЭМС добавляли в суспензию клеток перед помещением их на покровные стекла. Перед измерением внутриклеточного рН раствор ЭМС добавляли к прикрепленным к покровным стеклам клеткам и затем инкубировали 5 мин при 37о С.
Измерение внутриклеточного рН проводили методом микрофлуориметрии на флуоресцентном микроскопе "Opton III" с флуоресцентной приставкой ФМЕЛ-2. Клетки инкубировали в течение 1 ч с 6 мкмоль 2,7-бис(2-карбоксиметил)-5(6) карбоксифлуоресцеина, растворенного в диметилсульфоксиде, и отмывали от невключившегося красителя. Измерение флуоресценции в отдельных клетках проводили при длине волны 520 нм (при возбуждающем свете с максимальной длиной волны 435 и 495 нм). Внутриклеточный рН оценивали по соотношению интенсивностей флуоресценции.
Калибровку проводили нигерицин-калиевым методом, сущность которого заключается в выравнивании нигерицином значений наружного и внутриклеточного рН при низких концентрациях натрия в среде. Для проведения калибровки готовили серию растворов, содержащих 150 ммоль KCl, 15 ммоль NaCl, 10 ммоль глюкозы, 3x10-5 нигерицина, 10 ммоль HEPES с различным рН, помещали туда клетки, инкубировали 15 мин при 37о С, измеряли внутриклеточный рН и строили калибровочную кривую.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Влияние экстракта мумие сухого на адгезию тромбоцитов. Для изучения действия ЭМС на адгезию тромбоцитов к твердому субстрату объект исследования растворяли в растворе Хенкса и добавляли к суспензии клеток до их помещения на покровные стекла. Затем клетки фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида и подсчитывали количество клеток в поле зрения микроскопа.
Исследовалось влияние различных концентраций ЭМС на адгезию тромбоцитов (табл. 1).
| Концентрация ЭМС, мг/мл | Среднее число клеток в поле зрения (M±sigma) |
|---|---|
Контрольный опыт 0,0018 0,009 0,09 0,45 |
36±1 39±1 38±2 43±1 40±2 |
Из результатов опыта видно, что ЭМС не оказывает существенного влияния на процесс адгезии тромбоцитов. Клетки в контрольном опыте и клетки, обработанные ЭМС, морфологически не различались. Признаков токсического действия не было отмечено даже при максимальной дозе ЭМС (0,45 мг/мл).
Важным фактором, стимулирующим адгезию тромбоцитов, является АДФ, который содержится в гранулах тромбоцитов и высвобождается при стимуляции тромбоцитов коллагеном или тромбином. АДФ ускоряет процесс образования тромба, стимулирует тромбоциты к межклеточной адгезии и адгезии к субэндотелию и коллагену.
Поэтому мы исследовали также влияние мумие на АДФ-стимулированную адгезию тромбоцитов (табл. 2). АДФ в концентрации 40 мкмоль добавляли к суспензии клеток перед помещением их на покровные стекла.
| Концентрация ЭМС, мг/мл | Число подсчетов | Среднее число клеток в поле зрения (M±sigma) |
|---|---|---|
Контрольный опыт 0,00009 0,0009 0,009 0,09 |
11 13 13 13 11 |
40±2 36±3 43±1 39±1 35±1 |
Из табл. 2 видно, что в присутствии ЭМС не происходило изменений АДФ-стимулированной адгезии тромбоцитов.
Морфологическая структура клеток в контрольном опыте не отличалась от таковой в эксперименте. Некоторые токсические изменения (частичная дегрануляция, округление клеток) происходили при максимальной концентрации ЭМС (0,09 мг/мл).
Влияние экстракта мумие сухого на внутриклеточный рН. Митотическая активность клеток, в частности фибробластов, существенно зависит от плотности культуры. Поэтому в наших исследованиях были использованы фибробласты, посаженные с различной плотностью: клетки образуют группы, где каждая клетка контактирует с 3-5 соседними клетками (табл. 3), или клетки образуют конфлюэнтный монослой (табл. 4).
| Концентрация ЭМС, мг/мл | Соотношение интенсивностей флуоресценции |
Число клеток | рН (M±s) |
|---|---|---|---|
Контрольный опыт 0,09 0,9 |
1,84 1,92 1,88 |
13 13 11 |
7,10±0,03 7,15±0,02 7,12±0,02 |
| Концентрация ЭМС, мг/мл | Соотношение интенсивностей флуоресценции |
Число клеток | рН (M±s) |
|---|---|---|---|
Контрольный опыт 0,009 0,09 0,9 |
2,07 2,07 1,96 2,02 |
6 8 7 12 |
7,26±0,02 7,26±0,02 7,17±0,03 7,22±0,03 |
Из табл. 3 и 4 видно, что ни в одном случае ЭМС не повлиял на внутриклеточный рН фибробластов.
Изучение влияния ЭМС на внутриклеточный рН тромбоцитов (табл. 5) показало, что мумие вызывает значительное повышение внутриклеточного рН, пропорциональное концентрации препарата.
| Концентрация ЭМС, мг/мл | Соотношение интенсивностей флуоресценции |
Число клеток | рН (M±s) |
|---|---|---|---|
Контрольный опыт 0,009 0,09 |
1,94 2,10 2,33 |
14 14 14 |
7,16±0,01 7,30±0,03 7,48±0,03 |
Изменение внутриклеточного рН может быть индуцировано изменением наружного рН. В связи с этим мы измерили pH среды в присутствии различных концентраций ЭМС. Изменений рН cреды под действием максимально использованной концентрации препарата не было обнаружено.
ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты настоящей работы продемонстрировали, что физиологическая активность препарата мумие не связана с действием на адгезивную функцию тромбоцитов. Показано, что адгезия тромбоцитов к твердому субстрату не изменялась в присутствии ЭМС различных концентраций. Препарат не влиял также на АДФ-стимулированную адгезию тромбоцитов, т.е. не оказывал ни ингибирующего, ни усиливающего действия на процесс активации тромбоцитов.
Мы установили также, что исследуемый препарат не влияет на внутриклеточный рН клеток соединительной ткани фибробластов. В связи с этим можно предположить, что препарат не обладает митогенной активностью, так как митогены и белковые факторы роста, как правило, вызывают повышение внутриклеточного рН.
Проведенное исследование позволило установить, что только один из важнейших биохимических показателей - внутриклеточный рН тромбоцитов - значительно изменяется в присутствии ЭМС.
Значительное повышение внутриклеточного рН под действием ЭМС может вызывать существенные биохимические превращения клеток: увеличение активности ряда ключевых ферментов (протеинкиназы, фосфолипазы, синтеза простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов), обладающих высокой чувствительностью к концентрации ионов водорода. Такой механизм влияния мумие на клеточный метаболизм может быть реализован при прямом контакте клеток с мумие, например при наружных аппликациях на раневую поверхность, очаг инфекции и т.д.
Таким образом, механизм противовоспалительного и ранозаживляющего действия ЭМС не связан с его действием на клеточном уровне.
ВЫВОДЫ
- Изучено влияние ЭМС на спонтанную и АДФ-стимулированную адгезию тромбоцитов, внутриклеточный рН фибробластов и тромбоцитов.
- ЭМС не влияет ни на спонтанную (в концентрации 0,0018-0,45 мг/мл), ни на АДФ-стимулированную (в концентрации 0,00009-0,09 мг/мл) адгезию тромбоцитов.
- ЭМС в концентрации 0,009-0,9 мг/мл не оказывает влияния на внутриклеточный рН клеток соединительной ткани фибробластов.
- ЭМС в концентрации 0,009-0,09 мг/мл вызывает повышение внутриклеточного рН тромбоцитов.
- Изученные тесты нецелесообразно использовать в качестве критериев оценки качества мумие.
ЛИТЕРАТУРА
- Абу Али Ибн Сина (Авиценна). Канон врачебной науки.- Ташкент: Фан. - 1982. - Кн. 2.- 832 с.
- Амасиаци А. Ненужное для неучей.- М.: Наука. - 1990. - т.13. - С.302.
- Маджидов Н.М., Шакиров А.Ш., Юлдашев К.Н. Мумие - стимулятор регенеративных процессов.- Ташкент: Фан.- 1980.- 120 с.
- Ткаченко С.С., Руцкий В.В., Грачев И.Р. Репаративная регенерация костной ткани под воздействием мумие-асиль. // Ортопедия, травматология и протезирование. - 1972. - N11. - С.49-52.
- Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. - М.: Медицина, 1988. - С. 7-35.
EFFECT OF MUMIE ON INTRACELLULAR pH AND CELL ADHESION
T.L.Kiseleva, L.N.Frolova, L.A.Baratova, S.I.Galkina
Research Institute of Traditional Treatment Methods, Ministry of Public Health and Medical Industry of the Russian Federation
A study was made of the effect of the dry mumie extract on intracellular pH and cell adhesion. It has been established that this mumie extract produces no effect either on spontaneous or ADP-stimulated platelet adhesion, provokes no increase in intacellular pH of the cells of fibroblast connective tissue but raises intracellular pH of platelets. It is desirable that the tests under study may be used as criterion for estimation of mumie quality.
Mediko-farmatsevtichesky Vestnik N6,1996
-
Статья опубликована в ежемесячном журнале
"Медико-фармацевтический вестник" (N6'1996)
WWW-версия журнала на сервере "Медицина для Вас"
***